蝉花内生真菌多样性分析及菌株分离鉴定

史晓飒，张洪梅，刘腾飞，刘自尧，史新元

（北京中医药大学，北京 102488）

摘要：目的：探讨蝉花内生真菌的多样性，明确蝉花的寄生菌。方法：采用Illumina Miseq对江苏蝉花内生真菌进行多样性分析，采用传统分离培养法对蝉花内生真菌进行纯种分离培养，并用克隆测序对DNA的ITS序列进行测序，通过和NCBI数据库比对确定菌种。结果：Illumina Miseq测序Alpha多样性结果显示，Chao指数为11，Shannon多样性指数为0.313，Simpson多样性指数为0.891；OTU的数量为11个。蝉花内生真菌11个OTU均为蝉棒束孢属（Isaria）。通过传统分离培养法，分离得到菌株JS01，通过克隆测序与NCBI比对，结果显示菌种为大蝉草。结论：江苏茅山蝉花内生真菌丰富度较低，多样性较少，蝉花的寄生真菌为大蝉草。

关键词：蝉花；高通量测序；内生真菌；多样性；系统发育分析；寄生菌；大蝉草

Analysis on the diversity of endophytic fungus and identification of strain isolation in Chanhua

SHI Xiao-sa, ZHANG Hong-mei, LIU Teng-fei, LIU Zi-yao, SHI Xin-yuan

( Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China )

Abstract: Objective: To explore the diversity of endophytic fungus in Chanhua (Cordyceps cicadae), and to identify the parasitic bacteria of this flower. Methods: Illumina Miseq was used to analyze diversity of endophytic fungus of Chanhua. And endophytic fungus of Chanhua was isolated and cultured by traditional isolation culture method. The ITS sequence of DNA was sequenced by the sequencing of clone. The strain was determined by comparison with the NCBI database. Results: The Alpha diversity of Illumina Miseq sequencing showed that the Chao index was 11, the Shannon diversity index was 0.313, the Simpson diversity index was 0.891, and the OTU number was 11. Eleven OTU of endophytic fungus of Chanhua are Isaria cicadae. The strain JS01 was isolated from the traditional isolation culture method, and it was compared with NCBI by sequencing of clone. The results of comparison showed that the strain was Cordyceps cicadae sp. nov.. Conclusion: The endophytic fungus of Chanhua in Maoshan, Jiangshu is less abundant and less diverse. And Cordyceps cicadae sp. nov. is the parasitic fungus of Chanhua.

Key words: Chanhua; High-throughput sequencing; Endophytic fungus; Diversity; Phylogenetic analysis; Parasitic bacteria; Cordyceps cicadae

通讯作者：史新元，北京市房山区阳光南大街与白杨东路交叉口东北角北京中医药大学，邮编：102488，电话：010-84738621 E-mail：xyshi@126.com

蝉花（Cordyceps cicadae）又名蝉蛹草、蝉茸等，与冬虫夏草同属虫草属，是我国传统的中药材。蝉花是由麦角菌科（Claviceplaceae）真菌寄生在山蝉（Cicada flammata Dist）等蝉科昆虫若虫上而形成的复合体[1]。《证类本草》载：“蝉花味甘寒，无毒，祛风止痉，主治小儿天吊，夜啼心悸”。研究表明，蝉花与冬虫夏草有效成分组成和功能具有相似性，含有多糖、虫草酸、腺苷、麦角甾醇、虫草素等有效成分[2-3]，因此，蝉花可作为冬虫夏草的替代品[4]，其主要的药理活性有调节免疫[5-8]、抗肿瘤[9-11]、改善肾功能[12-15]、抗氧化[16-18]、抗菌[19-20]等。

蝉花在我国资源分布较广，不同产地蝉花菌株存在差异性，导致不同产地蝉花的有效成分和生物活性存在明显差异。同时随着蝉花近年来的广泛应用，天然蝉花资源呈日趋紧张的状态[21]，人工培养蝉花在缓解蝉花资源短缺方面具有积极作用，分离纯化选育出优良的蝉花寄生菌株是人工培养蝉花的关键环节，因此，研究蝉花内生真菌多样性并对蝉花内生真菌进行分离培养具有重要的意义。本文对江苏茅山采集的蝉花鲜品样品，运用Illumina Misq测序分析其内生真菌的多样性，并通过传统的分离纯化培养方式分离蝉花内生真菌，以期为蝉花人工培养提供优良菌株。

材料

1. 药材 蝉花鲜品采摘于江苏茅山，冰盒低温运输至实验室，转移至-80℃冰箱中保存。

2. 试剂 OMEGA土壤DNA提取试剂盒（Omega Bio-Tek，美国），FastPfu Polymerase（TransGen，中国），Axygen Biosciences（Axygen，美国），TruSeq™ DNA S ample P rep K it（Illumina，美国），NEP025-1胶回收试剂盒（鼎国昌盛，中国）。

3. 仪器 小型离心机（Eppendorf 5430R，Eppendorf，德国），高速台式冷冻离心机（Eppendorf 5424R，Eppendorf，德国），超微量分光光度计（NanoDrop20 0 0，Thermo Fisher Scientific，美国），电泳仪（DYY-6C，六一仪器厂，中国），PCR仪（ABI GeneAmp®9700型，ABI，美国），MISEQ测序仪（Illumina Miseq，Illumina，美国），HISEQ测序仪（Illumina hiseq，Illumina，美国），酶标仪（BioTek Elx800，Biotek，美国）。

方法

1. Illumina Miseq测序 将蝉花用自来水冲洗干净，再用75%乙醇浸泡30s，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干表面水分，用无菌手术刀和无菌镊将蝉花菌膜及蝉壳剥离，保留菌核部分，用液氮研磨成粉。

2. 基因组DNA提取和PCR扩增ITS序列 采用OMEGA土壤DNA提取试剂盒提取蝉花基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。使用含barcode的真菌TIS区特异引物ITS1（5’-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A-3’）和ITS2（5’-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3’）[22]进行PCR扩增，PCR反应体系：5×FastPfu Butter 4μL，Dntps（2.5mmol/L）2μL，Primer（5μmol/L）各0.8μL，FastPfu Polymerase 0.4μL，DNA模板10ng，ddH2O补足20μL；反应条件：95℃预变性2min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环，72℃延伸5min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（Axygen公司）切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱；2%琼脂糖电泳检测。

3. 文库构建和Illumina Miseq测序 使用New England Biolabs公司NEB Next®Ultra™ DNA Library Prep Kit for Illumina 建库试剂盒进行文库的构建。通过聚合酶和3’-5’核酸外切酶共同作用，修饰带有突出末端的DNA片段。在DAN片段的3’端加A尾，接入Index，并以P5/P7为引物PCR扩增进行文库模版的富集。将PCR产物用QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）进行检测定量和文库检测。将样品进行稀释至10nmol/L，用Illumina Miseq测序仪测序。本文的测序服务由上海美吉美吉桑格生物医药科技有限公司提供。

4. 生物信息学分析

4.1 原始数据处理 采用双峰（pair-end）测序，对原始数据进行质量控制，进行过滤，过滤条件：①reads中不能含有未知碱基；②碱基测序质量值<13的比例低于5%；③去除长度<50bp的reads。根据reads之间的重叠将其连接起来，获得最终用于分析的序列Tags。

4.2 OTU分析 用QIIME（version 1.17）对Tag序列进行去冗余处理，从中挑选出Clean Tag序列。在相似度为99%的水平上对Clean Tag序列进行OTU聚类[UPARSE（version 7.1）]，并用RDP Classifier（version 2.2）置信度阈值为0.8对真菌ITS序列与数据库Unite（Release 7.0）比对，进行物种注释。

5. 传统分离培养

5.1 分离培养 表面消毒：将整株新鲜蝉花用流水冲洗20min，转移至超净台，用无菌水冲洗2~3遍，再用75%乙醇进行表面消毒30s，无菌水冲洗3~5遍，再用0.1%（m/V）升汞溶液浸泡2~3min，再用无菌水冲洗干净，用滤纸将表面水分吸干。组织块培养：超净台中将整株蝉花用无菌手术刀和无菌镊分成子座、菌膜和菌核（僵虫体）3部分，菌膜：从新鲜的金蝉花样品上剥取；子座：从僵虫头顶切下；菌核：选取僵虫胸部，用灭菌解剖刀切去表皮。分别以（2~3）mm×（2~3）mm×（2~3）mm组织块接入PDA固体培养基（含氨苄青霉素和氯霉素，各50mg/L）中，置于恒温恒湿培养箱中，25℃，80%湿度进行暗培养，24h后倒置。待组织块周围有气生菌丝长出时，在超净台中，用无菌的接种环从菌落边缘挑取边缘菌丝，用稀释涂布平板法进行纯化培养，保存菌种。

5. 2 分子鉴定 采用S ol a r bio真菌基因组D NA提取试剂盒（D2 3 0 0）提取菌株DNA，采用真菌I T S通用引物T I S1（5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’）和ITS4（5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’）进行PCR扩增，PCR反应体系：5×FastPfu Butter 4μL，Dntps（2.5mmol/L）2μL，Primer（5μmol/L）各0.8μL，FastPfu Polymerase 0.4μL，DNA模板10ng，ddH2O补足20μL；反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸10min。2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，DNA凝胶回收试剂盒（NEP025-1）回收PCR产物，用T4 DNA连接酶将PCR产物连接到Pmd19T载体，并转化入DH5α感受态大肠杆菌中，筛选阳性克隆，挑取阳性菌落，用质粒提取试剂盒提取质粒，并送北京鼎国生物技术有限责任公司测序。将得到的序列去除载体序列，在NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上BLAST比对，确定菌株。

结果

1. Illumina Miseq测序结果

1.1 序列长度分布 江苏蝉花鲜品样品经测序，共获得69 099条有效序列，平均每条序列长度为277.962bp，最小长度257bp，最大长度301bp，序列长度分布见图1。从序列长度分布来看，与ITS目的区序列长度大致吻合。

1.2 物种注释与评估 由图2可知，随着测序数量的增加，曲线进入平坦期，说明再增加测序数量，样品的OTU个数不再增加，表明样品测序数量足够。Alpha多样性分析结果显示其Chao指数为11，Shannon指数为0.313，Simpson指数为0.891，Coverage指数为1，表明其多样性丰度较低；且由图3可知，蝉花内生真菌的物种丰富度较低，与物种注释情况相吻合。由表1可知，江苏蝉花鲜品样品经测序得到的69 099条有效序列共分为11个OTU（99%相似度）。样品共注释到1个属（Isaria），未注释到种。

2. 传统分离培养结果

2.1 形态鉴定结果

2.1.1 菌落形态：见图4。本样品通过分离纯化得到1个菌株，编号为JS01，菌株经稀释涂布纯化后在PDA固体培养基上培养得到单一菌落，菌落呈明显的圆形隆起，菌落致密，菌丝平伏，菌落白色，其上密布孢子粉，背面呈淡黄色。

2.1.2 孢子形态：见图5。分生孢子梗质粒或从基质菌丝长出，分生孢子呈长梭形或柱形，端部稍尖细，光滑透明。

图4 菌落形态

图5 孢子形态（×400）

2.2 分子鉴定结果

2.2.1 测序结果与系统发育树：克隆测序结果显示，分离得到的菌株ITS序列为：TCC GTA GGT GAA CCT GCG GAG GGA TCA TTA CCT GAG TTT TAC AAC TCC CAA CCC TTC TGT GAA CCT ACC CAT CGT TGC TTC GGC GGA CTC GCC CCA GCG TCC GGA CGG CCC TGC GCC GGC CCG CGA CCT GGA CCC AGG CGG CCG CCG GAG ACC ACG CAA CCC TGT ATC CAT CAG TCT CTC TGA ATC CGC CGC AAG GCA ACA CAA ATG AAT CAA AAC TTT CAA CAA CGG ATC TCT TGG TTC TGG CAT CGA TGA AGA ACG CAG CGA AAT GCG ATA CGT AAT GTG AAT TGC AGA ATT CCG TGA ATC ATC GAA TCT TTG AAC GCA CAT TGC GCC CGC CAG CAT TCT GGC GGG CAT GCC TGT TCG AGC GTC ATT TCA ACC CTC GAC GTC CCC TGG GAC GTC GGC CTT GGG GAC CGG CAG CAC CCC GCC GGC CCT GAA ATA GAG TGG CGG CCC GTC CGC GGC GAC CTC TGC GCA GTA CAA CCA CTC GCA CCG GGA ACC CGA CGC GGC CCG CCG TGA AAC CCC CAA CCT CTG AAC GTT GAC CTC GGA TCA GGT AGG ACT ACC CGC TGA ACT TAA GCA TAT CAA TAA GCG GAG GA，长度为587bp，通过Blast比对与分离菌株JS01相似度最高的前10个菌株分别是Cordyceps cicadae CCF菌株、Paecilomyces cicadae BA-001菌株、Limacella gioderma菌株、Ophiocordyceps sobolifera isolate JZB2115037菌株、Phytocordyceps cf. ninchukispora BCC15603菌株、Isaria cicadae BCC19486菌株、Cordyceps takaomontana VN1菌株、Cordyceps sp. BCC14567菌株、Gibellula formosana菌株及Beauveria bassiana iolate Sc2533菌株，其序列相似度都达到了99%。结合Genebank上的虫草有关序列构建系统发育树（图6）。

通过测序结果与系统发育树可以得出分离得到的菌株JS01与大蝉草（Cordyceps cicadae）相似度为99%，且处于同一进化分支，可认为菌株JS01既为大蝉草（Cordyceps cicadae）。

图6 系统发育树

讨论

ITS序列[真菌核糖体基因转录间隔区（internal transeribed spacer）]由Gonzalea在1990年提出作为新的分子标记，ITS序列片段较小，人们可以从不太长的序列中获得足够的信息，易于分析，现已被广泛应用于真菌生物群落分析、分类鉴定、检测等[23-24]。本研究应用Illumina MiSeq高通量测序技术，克服传统分子生物学方法分离鉴定菌种种类有限的不足，从基因组的水平解析蝉花内生真菌微生物的群落结构。但由于Illumina MiSeq高通量测序技术难以将菌株鉴定至种的分类水平，利用传统分离培养和rDNA-ITS序列分析对测序鉴定的结果进行弥补，对分离菌株鉴定至种的分类水平，且可以分离纯化得到蝉花的寄生真菌，为人工培养蝉花提供优势菌株。

本研究Illumina MiSeq测序结果显示，OTUs个数较少，表明江苏蝉花内生真菌物种丰富度和多样性较低，通过物种注释发现蝉花内生真菌均为棒束孢属（Isaria），这与前人通过传统的分离培养的方法确定蝉花寄生真菌结果相同[25]，也有研究者通过分离培养得到蝉花的寄生真菌为蝉拟青霉（P.cicadae）[26-27]，蝉拟青霉（P.cicadae）是蝉棒束孢菌（I.cicadae）的同物异名，因此，本文通过Illumina MiSeq测序分析蝉花内生真菌多样性，明确了蝉花是由单一菌种寄生在山蝉等蝉类昆虫若虫上而形成的复合体，为人工培养蝉花提供了基础。

本研究根据Illumina MiSeq测序结果选用PDA培养基对蝉花内生真菌进行分离纯化，通过克隆测序，对分离菌株JS01的ITS序列测定，比对结果显示，菌株JS01为大蝉草（Cordyceps cicadae）。大蝉草（Cordyceps cicadae）为是蝉棒束孢菌（I.cicadae）的有性型。自然界中有性型菌株较为稀少，因此分离得到的菌株JS01需要更加进一步的测序，确证菌株JS01为大蝉草（Cordyceps cicadae）。

本研究首次应用Illumina MiSeq通过ITS序列测定分析蝉花内生真菌多样性，确证了蝉花是由单一菌种寄生在山蝉等蝉科昆虫若虫上而行成的虫草复合体，发现蝉花的寄生菌株为棒束孢属（Isaria）。通过传统分离纯化培养的方法，分离得到一株菌株JS01，通过克隆测序，鉴定为蝉棒束孢菌（I.cicadae）的有性型大蝉草（Cordyceps cicadae）。

参 考 文 献

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（收稿日期：2017年7月17日）