浙江天目山蝉花虫草的分离及基质栽培
饶雨欣1 , 郎茂荣2 , 江宏1 , 童小青1 , 王勇军1∗
(1. 浙江农林大学 林业与生物技术学院, 浙江 杭州 311300; 2. 杭州临安华茵生物技术有限公司, 浙江 杭州 311300)
摘要: 在浙江天目山竹林土壤感染的竹蝉若虫上分离获得了一株蝉花虫草TM06 菌株, 分析了TM06 菌株ITS 序列, 采用小麦为基质建立了TM06 菌株的基质栽培技术。结果表明, 分离获得的TM06 菌株与蝉花虫草亲缘关系最近, 以小麦为基质可培养蝉花虫草TM06 的子实体, 添加5%的蝉蛹粉可显著提高子实体产量, 每瓶子实体干重平均为11. 61 g。
关键词: 蝉花虫草; 分离培养; 基质栽培
中图分类号: S567. 3
文献标志码: B
文章编号: 0528-9017(2021)06-1097-03
收稿日期: 2021-04-20
基金项目: 浙江省林业局省院合作项目(L20180056)
作者简介: 饶雨欣(1999—), 女, 贵州贵阳人, 硕士研究生, 研究方向为森林微生物学研究, E-mail: 444584049@ qq. com。
通信作者: 王勇军(1981—), 男, 江西抚州人, 副教授, 从事森林病理与微生物学研究工作, E-mail: wangyj@ zafu. edu. cn。
蝉花虫草(Cordyceps cicadae) 又名蝉茸、虫花、蝉虫草、蝉茸菌, 为蝉棒束孢菌真菌寄生于蝉若虫后形成的菌虫复合体, 是我国一种传统的药食两用真菌。宋代唐慎微《经史证类备急本草》记载“味甘, 寒, 无毒; 主小儿天吊, 惊痫螈, 夜啼心悸; 所在皆有, 七月采; 生苦竹林者良, 花出土上”。在现代医学中, 蝉花含有糖原、甘露醇、多种生物碱、蛋白质、多种氨基酸及多种微量元素等化学成分, 具有免疫调节、代谢调节、解热镇痛、镇静催眠、改善肾功能、降血糖、抗肿瘤等药理作用[1-2] 。蝉花虫草为世界性广布种, 在我国分布于秦岭淮河以南, 主要生长于热带和亚热带的阔叶林、针阔叶混交林及竹林等生境中[3] 。蝉花虫草的寄主主要包括山蝉Cicadae flammata、蟪姑 Platypleura kaempferi、黑蚱Crytotympana pustulata、竹蝉Platylomia pieli 等蝉科昆虫[4] 。笔者在浙江省杭州市天目山区进行资源调查时发现, 蝉花虫草广泛分布于竹林中, 长期被当地竹农采收并作为药用真菌。本研究从天目山竹林土壤感染竹蝉中分离获得1 株蝉花虫草菌株TM06, 并进行了人工栽培探索, 为蝉花虫草资源开发提供了基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 蝉花虫草菌株
蝉花虫草分离物TM06 采集于浙江省杭州市临安区天目山竹林(119°31′1″E 30°20′7″N) 土壤感染的竹蝉。
1. 1. 2 培养基
PDA 培养基。马铃薯200 g, 葡萄糖20 g, 琼脂18 g, 水1 000 mL, pH 7. 0, 121 ℃灭菌30 min。
M1 液体培养基。马铃薯200 g, 葡萄糖30 g, K2 HPO4 0. 5 g, MgSO4 1 g, 柠檬酸铵1 g, 蛋白胨 3 g, 复合维生素B 150 mg, 水1 000 mL, 121 ℃ 灭菌30 min。
小麦基质培养基。每个玻璃培养瓶(5 cm × 5 cm×10 cm) 分别装入约25 g 小麦和20 mL 的M1 液体培养基, 添加不同量的蝉蛹粉, 混匀后121 ℃ 灭菌30 min。
市售蝉蛹粉, 过0. 15 mm 筛后备用。
1. 2 方法
1. 2. 1 真菌的分离
用小铲子取露出蝉花的虫体, 拭去黏附土壤,置于取样袋中, 放入冰盒带回实验室进行分离纯化。用剪刀剪取蝉花组织, 表面用75% 酒精消毒10 s 后, 用无菌水进行冲洗2 遍后, 用镊子撕开表皮, 取长、宽为1 mm 大小的组织块, 接种于PDA培养皿中, 避光条件下24 ℃ 培养。待菌丝长出,用挑针挑取少量菌丝置于新鲜PDA 培养皿中进行培养, 观察菌丝形态, 获得纯培养物。
1. 2. 2 ITS-PCR 及序列测定
采用Ezup 柱式真菌基因组DNA 抽提试剂盒(生工®, 上海) 进行真菌菌丝总DNA 的提取,采用真菌核糖体基因间隔区(ITS) 通用引物ITS1 (5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′) 和ITS4 (5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′) 对基因组DNA 进行PCR 扩增。扩增体系为94 ℃, 5 min; 94 ℃, 45 s,55 ℃ , 45 s, 72 ℃ , 1 min, 30 个循环; 72 ℃ , 8 min。将扩增得到的DNA 片段送至生工生物工程(上海) 股份有限公司双向测序, 采用DNAMAN软件进行拼接。序列采用MEGA 7. 0 软件进行系统发育树构建, 采用Maximum Likelihood analysis 进行分析, 自展数据(bootstrap) 为1 000 次[5] 。
1. 2. 3 蝉花虫草的人工栽培
取在PDA 培养基生长的蝉花虫草菌丝块, 置于M1 液体培养基中, 160 r·min-1 , 22 ℃ 黑暗条件进行震荡培养, 培养6 d, 至菌丝小球长出, 用小型搅拌器混匀后, 吸取1 mL 菌液添加至含有不同浓度蝉蛹粉的小麦基质培养基, 黑暗条件22 ℃下进行培养, 待菌丝长满培养瓶, 进行光照诱导(黑暗12 h/ 光照12 h), 待生长成熟后, 取子座组织进行称重。
1. 3 数据统计与分析
采用SPSS v. 19 数据系统进行统计分析, 采用Duncan’s 新复极差法进行显著性分析。
2 结果与分析
2. 1 蝉花虫草TM06 的分离培养及人工基质栽培
采集的蝉花是由虫体和孢梗束两部分组成的生物体, 寄生的蝉若虫较大, 表面披覆着灰白或灰黄色的茸毛状菌被。蝉花子座一般单生、2 个或多个,不分支, 呈棒状、褐色; 蝉花的孢梗束由蝉的前端长出, 单生或丛生, 上部反复分枝, 分枝顶端膨大(图1 中A)。蝉花菌丝在PDA 培养基上菌丝白色,稀松, 底部产红色色素, 易形成孢子(图1 中B)。
蝉花虫草TM06 菌株在小麦基质培养基上培养将近10 d 后, 白色菌丝布满整个基质; 15 d 后,子座形成, 有子实体长出, 菌体颜色加深, 呈淡黄色; 40 d 后, 子实体生长茂密, 高5 ~ 7 cm, 直径1~ 3 mm, 顶部有大量珊瑚状分支, 子实体成熟(图1 中C)。
图1 蝉花虫草TM06 的分离( A 和B) 及基质栽培( C)
2. 2 蝉花虫草TM06 的ITS 遗传系统分析
利用引物ITS1 和ITS4 进行PCR 扩增, 获得蝉花虫草TM06 的ITS 部分序列, NCBI 登录号为MW040504。利用MEGA 7. 0 软件构建系统发育树,分析结果显示, TM06 与蝉花虫草QCS2007071701菌株和JGS2014061604 菌株亲缘关系最近, 构成1个分支(图2)。
图2 基于ITS 序列构建的系统发育树
2. 3 添加不同浓度的蝉蛹粉对TM06 子实体产量的影响
在小麦基质培养基中分别添加2%、5%、10%和15% (重量百分比) 的蝉蛹粉, 测定蝉蛹粉对蝉花虫草TM06 子实体生长的影响。由表1 可知,小麦基质培养基中添加蝉蛹粉后, 子实体干重明显提高。其中, 添加5%的蝉蛹粉效果最佳, 子实体每瓶平均干重达到11. 61 g。同时发现, 蝉蛹粉添加超过10%时, 反而降低了子实体的产量。
3 小结与讨论
虫草属真菌的资源挖掘和人工栽培, 是当前研究和开发的热点, 对功能食品开发和野生资源保护均具有重要意义[6] 。本研究从浙江天目山竹林感染的蝉若虫上分离获得1 株蝉花虫草TM06, 采用小麦基质培养基完成了该菌株的人工栽培, 并测定了蝉蛹粉对TM06 菌株人工栽培下的增效作用。研究结果明确了浙江天目山竹林蝉花的菌种特性, 并建立了人工栽培技术。蝉花虫草的药理成分及药效功能已取得重要进展[1,7-8] , 但不同来源、不同栽培方式的虫草, 在药理成分及功效上可能存在差异[9] 。下一步将围绕人工栽培的蝉花虫草的药理学成分及功效开展研究。
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(责任编辑: 张瑞麟)