一株蝉花的ＩＴＳ序列分析及产纤溶酶条件的研究

龙良鲲１，梁子豪１，林群英２，胡　毅１，吴文杰１，丁少军１

（１．南京林业大学化学工程学院，江苏南京２１００３７；２．中华全国供销合作总社南京野生植物综合利用研究院，江苏南京２１００４２）

摘要：以新分离的蝉花（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ　ｃｉｃａｄａｅ）ＣＣ１５０４为试材，通过真菌核糖体ＤＮＡ内转录间隔区（ＩＴＳ）序列分析确定菌株的分类学地位；利用琼脂糖－纤维蛋白平板法测定蝉花产纤溶酶的能力，通过单因素试验确定其液体发酵产纤溶酶的最适碳源和最适氮源；以正交实验优化菌株产纤溶酶的培养基组成。结果表明：ＩＴＳ序列进化树分析确定了该菌株的分类地位为蝉花；该蝉花产纤溶酶的最适碳源为乳糖，产酶水平为２４８．９５Ｕ·ｍＬ－１，其次是甘油，为１９８．９４Ｕ·ｍＬ－１；蝉花产纤溶酶的最适氮源为蛋白胨，产酶水平可达２４０．６８Ｕ·ｍＬ－１，其次是酵母膏，为８９．２３Ｕ·ｍＬ－１；获得的最佳培养基碳氮源组成为：乳糖１０ｇ·Ｌ－１、蛋白胨１０ｇ·Ｌ－１、酵母膏３ｇ·Ｌ－１，可发酵获得的纤溶酶水平达２６２．０５Ｕ·ｍＬ－１。

关键词：蝉花；纤溶酶；营养条件；液体发酵

中图分类号：Ｓ５６７.３＋５　

文献标识码：Ａ　

文章编号：１００１－０００９（２０１８）０３－００２８－０６

第一作者简介：龙良鲲（１９７８－），男，博士，副教授，现主要从事微生物活性物质等研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｏｎｇｌｋ６０２＠ｎｊｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ．

责任作者：丁少军（１９６４－），男，博士，教授，博士生导师，现主要从事微生物酶与生物技术等研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｓｈａｏｊｕｎ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ．

基金项目：江苏省高校自然科学基金资助项目（１５ＫＪＢ２２０００３）；南京林业大学大学生创新训练计划资助项目（２０１５ｓｊｃｘ０３３）；江苏省大学生科技创新计划资助项目（２０１６１０２９８１０４Ｘ）。

收稿日期：２０１７－０７－１８

蝉花（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ　ｃｉｃａｄａｅ）俗称大虫草，是蝉若虫感染蝉拟青霉（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ　ｃｉｃａｄａｅ）后形成的虫生真菌，分类学上归入麦角菌科虫草属，主要分布于我国南方各省［１］。据史书记载，蝉花用于治疗“小儿天吊，惊痫，夜啼，心悸”，民间常用来制备药酒［２］。现代药理学研究表明，蝉花可产生多糖、甘露醇、麦角甾醇、腺苷和多球壳菌素等多种活性物质，具有抗疲劳、抗衰老、抗氧化、抗菌、镇静、解热镇痛和免疫调节等多种功效［１－５］。蝉花能够实现规模化人工培养，其作为冬虫夏草的重要替代品，具有巨大的市场开发价值。

不同地理来源的蝉花菌株，其生理特性和药用成分各异［１］。充分认识蝉花的药用活性成分和产生条件，是高效利用这类资源的重要前提。纤溶酶（Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ　ｅｎｚｙｍｅｓ）是一类广泛存在于动植物及微生物细胞中的能够降解纤维蛋白凝胶的蛋白水解酶。目前，利用天然来源的纤溶酶开发溶栓药物，成为治疗心脑血管疾病的重要途径［６－７］。虫草类真菌能够产生纤溶酶，如蛹虫草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ　ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）在液体发酵条件下能够产生多种纤溶酶组分［８－１０］。但对蝉花产纤溶酶的研究尚鲜见报道。该试验对筛选到的１株蝉花产纤溶酶的条件进行研究，以期为抗血栓药物的研制提供新的生物材料。

１　材料与方法

１．１　试验材料

１．１．１　菌种与试剂

蝉花菌株ＣＣ１５０４以野生鲜蝉花子实体（采集地为贵州省雷公山）为材料分离获得。该菌株接种于ＰＰＤＡ培养基（马铃薯２００ｇ·Ｌ－１、葡萄糖２０ｇ·Ｌ－１、蛋白胨５ｇ·Ｌ－１、琼脂２０ｇ·Ｌ－１，自然ｐＨ），２５℃培养１４ｄ，４℃冰箱保存。植物基因组ＤＮＡ提取试剂盒及分子生物学试剂为北京全式金生物技术公司产品；琼脂糖为上海生物工程有限公司产品；凝血酶、尿激酶和牛血纤维蛋白原均购于上海经科化学科技有限公司；其它试剂为国产分析纯。

１．１．２　液体菌种

取１００ｍＬ　ＹＰＤ培养基（葡萄糖２０ｇ·Ｌ－１，蛋白胨８ｇ·Ｌ－１，酵母浸膏１ｇ·Ｌ－１，ＫＨ２ＰＯ４１ｇ·Ｌ－１，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ　０．５ｇ·Ｌ－１，ｐＨ　６．５）装入２５０ｍＬ三角瓶，灭菌处理。将斜面培养的蝉花菌种接入培养基中，２５ ℃、１６０ｒ·ｍｉｎ－１振荡培养４ｄ，可用于液体发酵的种子液。

１．２　试验方法

１．２．１　蝉花菌株的ＩＴＳ序列分析

取菌株ＣＣ１５－０４ 接入ＰＤＡ 液体培养基，２５℃、１６０ｒ·ｍｉｎ－１振荡培养４ｄ。收集菌丝体，液氮充分研磨后，以植物基因组ＤＮＡ 提取试剂盒制备总ＤＮＡ。参考文献［１１］，采用真菌内转录间隔区（ＩＴＳ）的通用引物ＩＴＳ１：５′－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３′ 和ＩＴＳ４：５′－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３′进行ＰＣＲ扩增。扩增体系２０μＬ：ｄｄＨ２Ｏ　１２．２μＬ，５×ｂｕｆｆｅｒ　４μＬ，ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１）１．６μＬ，Ｔａｑ（ｐｆｕ）０．４μＬ（０．５ Ｕ），ＩＴＳ１（１０μｍｏｌ·Ｌ－１）０．４ μＬ，ＩＴＳ４（１０μｍｏｌ·Ｌ－１）０．４μＬ，ＤＮＡ　１μＬ。反应程序：９５℃预变性３ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，５５℃复性３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，２５个循环；７２℃终延伸５ｍｉｎ。扩增产物经１％ 琼脂糖凝胶电泳检测后，取２０ｎｇ目标产物连接到ｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔ克隆载体。筛选阳性克隆送铂尚生物技术（上海）有限公司完成序列分析。获得的目标ＩＴＳ 序列经ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）数据库ＢＬＡＳＴ比对分析，并选取其它真菌来源的同源序列，借助ＭＥＧＡ　７．０软件以邻位法构建系统进化树，确定菌株的分类地位。

１．２．２　碳源对蝉花产纤溶酶的影响

以不同的碳源（２０ｇ·Ｌ－１）代替ＹＰＤ培养基中的葡萄糖，分别配制发酵培养基。按２％（Ｖ／Ｖ）的接种量接入液体菌种，２５℃、１６０ｒ·ｍｉｎ－１振荡培养４ｄ。７　０００ｒ·ｍｉｎ－１离心２０ｍｉｎ，收集菌丝体和发酵液。菌丝体在５０℃下烘至恒重，称重。上清液即发酵液４℃保存，用于纤溶酶活性测定。以不添加碳源的培养基为对照（ＣＫ－Ｃ），每处理３次重复。

１．２．３　氮源对蝉花产纤溶酶的影响

以不同氮源（９ｇ·Ｌ－１）代替ＹＰＤ培养基中的蛋白胨和酵母浸膏，并配制发酵培养基。同上进行液体发酵试验，并设置不添加氮源的培养基作为对照（ＣＫ－Ｎ）。每处理３次重复。

１．２．４　正交优化实验

根据以上单因素试验获得的菌株产酶最适碳源和氮源的结果，按照表１和表２设计正交优化实验，分析蝉花菌株发酵产纤溶酶的最优培养基配方。

１．３　项目测定

纤溶酶活性测定的标准曲线参照文献［１２］，以琼脂糖－纤维蛋白平板法进行纤溶酶活性的测定。Ａ液：称取０．０３ｇ琼脂糖，加入３ｍＬ　ＰＢＳ缓冲液溶液（０．８ｇ　ＮａＣｌ，０．０２ｇ　ＫＣｌ，０．１４４ｇＮａ２ＨＰＯ４，０．０２４ｇ　ＫＨ２ＰＯ４，调节ｐＨ　７．４，定容至１００ｍＬ），加热溶解，置于５５℃，备用。Ｂ液：称取２５ｍｇ牛血纤维蛋白原，加入２．５ｍＬ　ＰＢＳ缓冲液，充分溶解，室温备用。取１０Ｕ 的凝血酶，加入０．５ｍＬ　ＰＢＳ缓冲液。Ａ液、Ｂ液及凝血酶溶液快速混合后制备琼脂糖－纤维蛋白平板。在纤维蛋白平板上打直径为５ｍｍ 的圆孔，孔内加入的不同浓度的尿激酶标准品（６２～６２０Ｕ·ｍＬ－１），于３７℃保温１８ｈ后测量溶解圈的直径。以溶解圈面积的对数为横坐标，酶活力对数为纵坐标，建立标准曲线。以蝉花菌丝发酵液代替尿激酶标准品，测定纤溶酶活性。

１．４　数据分析

采用Ｏｒｉｇｉｎ软件进行作图，采用ＳＰＳＳ　１１．０软件对试验数据进行分析。

２　结果与分析

２．１　蝉花菌株的ＩＴＳ序列分析

成功提取了蝉花菌株ＣＣ１５０４ 的基因组ＤＮＡ，并扩增获得了其ＩＴＳ序列（图１）。测序结果显示，该菌株的ＩＴＳ序列全长５８７ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登陆号：ＫＹ９２４４９１）。ＢＬＡＳＴ分析显示，该序列与ＧｅｎＢａｎｋ中蝉花菌株的ＩＴＳ序列相似度最高，其中与Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ　ｃｉｃａｄａｅ　ＣＣＦ菌株的ＩＴＳ序列（ＫＰ７７１８７９）相似率为１００％。进一步的系统进化树分析表明，其与蝉花菌株处于同一进化分支，确定其分类地位为Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ　ｃｉｃａｄａｅ（图２）。

２．２　纤溶酶活性测定的标准曲线

通过琼脂糖－纤维蛋白平板法能够检测到蝉花发酵液中存在纤溶酶活性。通过尿激酶标准品测定其对纤维蛋白的溶解能力，以溶解圈面积对数为横坐标（ｘ），酶活力对数为纵坐标（ｙ），建立了纤溶酶活性的标准曲线公式：ｙ＝４．７４ｘ－７．７２，Ｒ２＝０．９９６ ３。

２．３　蝉花产纤溶酶的最适碳源

从图３可以看出，碳源的类型显著影响蝉花产纤溶酶的能力。以乳糖为碳源时，发酵液中纤溶酶活性最高，达２４８．９５Ｕ·ｍＬ－１；甘油次之，为１９８．９４Ｕ·ｍＬ－１；而葡萄糖及可溶性淀粉的酶活水平分别为９２．５７、７８．０２Ｕ·ｍＬ－１。以蔗糖处理组及对照组（ＣＫ－Ｃ）均不能检测到纤溶酶活性。可溶性淀粉作为碳源，蝉花的生物量最大，达到１４．２ｇ·Ｌ－１；乳糖为碳源时，菌丝体生物量最低，为８．１ｇ·Ｌ－１，略高于对照组的６．８ｇ·Ｌ－１。由此可知，蝉花纤溶酶的产量与菌体生物量无必然的联系。

２．４　蝉花产纤溶酶的最适氮源

由图４可知，蛋白胨作氮源时，蝉花产纤溶酶的水平最高，可达２４０．６８Ｕ·ｍＬ－１；其次为酵母膏，为８９．２３Ｕ·ｍＬ－１；以牛肉膏或硫酸铵为氮源时，纤溶酶活性极低，分别为１．７１、１．４７Ｕ·ｍＬ－１。对照组（ＣＫ－Ｎ）不能检测到纤溶酶活性。因此，氮源是蝉花产生纤溶酶的重要影响因子之一。以蛋白胨作为氮源时，蝉花菌丝量最高（１２ｇ·Ｌ－１），而酵母膏、牛肉膏及硫酸铵处理组的生物量依次递减。由此可以认为，氮源对蝉花合成纤溶酶的影响与其影响菌体生长存在一定的联系。

２．５　培养基组成的正交实验优化

以乳糖为碳源，蛋白胨和酵母膏为氮源，利用正交实验对蝉花发酵产纤溶酶水平进行培养基组成的优化（表２）。结果表明，酵母膏对蝉花发酵产纤溶酶的影响最大，Ｒ 值为７６．２２；其次为蛋白胨，Ｒ 值为５０．６１；乳糖的影响最小，Ｒ 值为５．７９。最优的发酵培养基中碳、氮源分别为：乳糖１０ｇ·Ｌ－１、蛋白胨１０ｇ·Ｌ－１、酵母膏３ｇ·Ｌ－１。以优化的培养基进行蝉花发酵，获得的纤溶酶水平可达２６２．０５Ｕ·ｍＬ－１。

３　讨论与结论

蝉花是一类重要的中草药资源，可产生多球壳菌素、多糖、虫草素等多种活性物质［１，３］。该试验对一株野生蝉花子实体的分离培养株ＣＣ１５０４进行了分子鉴定。通过ＩＴＳ序列系统进化分析，确定了该菌株的分类地位属于蝉花。液体发酵试验表明，该蝉花菌株具有产生纤溶酶的能力。张红霞等［１３］研究发现，营养条件对蝉花生物活性物质的合成有着重要影响。该研究通过单因素试验，明确了蝉花产纤溶酶的最佳碳源是乳糖，最佳氮源是蛋白胨。进一步的正交实验表明，最优发酵培养基中碳氮源分别为：乳糖１０ｇ·Ｌ－１、蛋白胨１０ｇ·Ｌ－１、酵母膏３ｇ·Ｌ－１。以该配方进行蝉花发酵，纤溶酶产生水平高达２６２．０５Ｕ·ｍＬ－１。目前，主要针对虫草真菌中的蛹虫草进行了产纤溶酶的研究，其发酵水平约为１００Ｕ·ｍＬ－１［９，１４］。该研究数据显示，蝉花产纤溶酶的水平约为蛹虫草菌株的２倍，其是开发抗血栓药物的重要生物资源。

比较蝉花发酵的生物量，发现可溶性淀粉为其最佳利用碳源，这与报道的蛹虫草菌株多以葡萄糖或蔗糖为最佳碳源的结论不同［１５］。同时，蝉花能够良好的利用蛋白胨、酵母粉或牛肉膏等氮源，这与多数蛹虫草菌株的最佳氮源相一致［１６］。蝉花资源在我国南方分布广泛，具有丰富的生态多样性，是否存在合成更高活性纤溶酶的菌株，这需要进一步研究。此外，虫草真菌在人工培养条件下均存在菌种易退化的问题，蝉花离开天然宿主也极易发生退化［１７］。因此，后续重点研究蝉花的纤溶酶合成基因及明确其活性组分和酶学特性，将有助加快这一资源的产业化应用。

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