接第一篇：

2.2 动物实验验证结果

2.2.1 蝉花核苷提取物中核苷类活性成分鉴定

按1.3.1 中的方法测得蝉花核苷提取物中核苷成分含量(表4，图9)，可见蝉花核苷提取物中主要有胸苷、腺嘌呤、尿苷、肌苷、腺苷和HEA成分，核苷总量达2.06%。网络药理学推测出的五大核心活性成分中，此蝉花核苷提取物包括4 种(腺嘌呤、HEA、肌苷、腺苷)，推测有较强的抗日光性皮炎的活性。

2.2.2 蝉花核苷提取物减轻UVB 诱导的SD 小鼠皮肤的组织病理学改变

通过第一天照射，连续7 d 给药的模型，并且每天给药前进行拍照记录(图10，图11A，表5)。模型对照组与空白对照组对比，可见明显的红斑起皮、皮肤增厚、皮革状痂块。经过蝉花核苷提取物的给药(CCL+CCH)，与模型对照组对比有明显的改善，红斑减少，愈合速度快。

HE 染色结果(图11B–11D)可知，模型对照组视野内皮肤组织表皮可见小范围角化过度，局灶性颗粒层增厚，较大范围棘层肥厚；真皮层结缔组织排列较紧密，可见少量淋巴细胞散在浸润，并偶见坏死细胞碎片；皮肤附属器毛囊及皮脂腺等散在分布，数量少，偶见毛囊坏死，结构不清，与空白对照组对比明显表皮厚度增厚；经过给药后有明显的皮肤改善，CCH 组视野内皮肤组织表皮表面可见大范围坏死物，较大范围角化不全；真皮层结缔组织排列紧密，可见少量淋巴细胞散在浸润；皮肤附属器毛囊及皮脂腺等散在分布，数量丰富，且表皮厚度明显改善。Masson染色结果可知，模型对照组小鼠在UVB 照射后明显胶原纤维减少，皮肤松弛，经过给药后，KFXY、CCL 和CCH 组有明显的改善，皮肤胶原纤维增多皱纹不明显。总的结果来看，蝉花核苷提取物明显改善了UVB 诱导小鼠的皮肤损伤。

2.2.3 蝉花核苷提取物对UVB 诱导的日光性皮炎小鼠氧化应激和炎症的影响

为了研究蝉花核苷提取物对日光性皮炎小鼠的氧化应激和炎症的保护作用，对小鼠皮肤组织进行生化和ELISA 检测(图12)。与空白对照组相比，模型对照组小鼠皮肤组织中SOD 含量显著降低，PTGS2 的含量显著升高，TNF-ɑ、IL-1β、IL-17 等炎症因子的含量显著升高。这说明UVB 照射会导致小鼠氧化应激失衡以及炎症反应的发生。给药组经过给药后有明显的改善。CCL 和CCH 组与模型对照组相比，可以发现给药后SOD 的活性升高，PTGS2 的含量显著降低，TNF-ɑ、IL-1β、IL-17 等炎症因子的含量显著降低，同时呈剂量依赖性，高剂量的治疗效果更好，优于阳性药的疗效。这说明蝉花核苷提取物可以保护日光性皮炎小鼠的UVB 光损伤。

图12 蝉花核苷提取物对SD 小鼠氧化应激和炎症的保护作用 

采用ELISA 试剂盒和生化检测SOD (A)、PTGS2 (B)、TNF-α (C)、IL-1β (D)和IL-17 (E)的水平；ns 为无显著性，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1；下同

Fig. 12 Protective effects of Cordyceps chanhua nucleoside extracts against oxidative stress and inflammation in SD mice. The levels of SOD (A), PTGS2 (B), TNF-α (C), IL-1β (D) and IL-17 (E) were detected using ELISA kits and biochemical assays. ns were non-significant, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.000 1. The same below.

2.2.4 蝉花核苷提取物抑制了日光性皮炎小鼠MAPK 信号通路的激活

为了进一步探讨蝉花核苷提取物抗日光性皮炎是否通过MAPK 信号通路作用，通过Western blotting 检测p38 的磷酸化水平。结果显示UVB 照射后小鼠皮肤组织内的p38 蛋白磷酸化水平与空白对照组对比显著升高，经过蝉花核苷提取物给药后，有明显的降低(P<0.000 1)。这说明蝉花核苷提取物抗日光性皮炎是通过抑制MAPK 信号通路进行作用的，这与先前的网络药理学筛选结果一致。UVB 照射模型对照组的MMP9 相比空白对照组有明显的含量增多，给药后有显著的降低(P<0.000 1)，并且具有剂量依赖性，这与Masson 染色的结果相一致(图13)。

图13 蝉花核苷提取物抑制SD 小鼠的MAPK 信号通路

A：p-p38、p38 和β-Actin 的免疫印迹；B：根据图A 中的Western blotting 图像对p-p38/β-Actin 进行定量；C：根据图A 中的Western blotting 图像对p-p38/p38 进行定量；D：根据图A 中的Western blotting 图像对MMP9/β-Actin 进行定量

Fig. 13 Cordyceps chanhua nucleoside extracts inhibit the MAPK signaling pathway in SD mice. A: Immunoblotting of p-p38, p38 and β-Actin. B: Quantification of p-p38/β-Actin according to the Western blotting image in figure A. C: Quantification of p-p38/p38 according to the Western blotting image in figure A. D: Quantification of MMP9/β-Actin according to the Western blotting image in figure A.

3 讨论

研究发现在虫草类真菌治疗紫外线诱导的皮肤损伤中，虫草提取物可以抑制UVB 诱导的角质形成细胞水通道3 (aquaporin-3, AQP3)和基质金属蛋白酶-9 (matrix metalloproteinase-9, MMP-9)的表达，从而减少胶原蛋白降解来保护皮肤(He et al. 2020)；Tang et al. (2019)发现虫草提取物增强了皮肤抗光老化的能力，提高了UVB 照射后的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的活性，并降低了UVB 照射导致的丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量。多项研究证明虫草类中药具有成为治疗日光性皮炎药物的潜力。

研究表明虫草属中的核苷类成分主要包括尿苷、腺嘌呤、鸟苷、虫草素、肌苷、N6-(2 羟乙基)腺苷等(葛琦等 2019)，网络药理学发现蝉花中抗日光性皮炎的核苷类活性成分主要是胸腺嘧啶、腺嘌呤、N6-(2 羟乙基)腺苷、肌苷、腺苷。分子对接主要是腺苷、肌苷、HEA 与日光性皮炎靶点PTGS2、MAPK1 结合紧密。HEA 又称虫草菌素，是第一个生物来源的钙离子拮抗剂，具有抗紫外辐射的功效(刘宽博等2017)。蝉花提取出的N6-(2 羟乙基)腺苷(HEA)可以通过抑制TLR4 介导的NF-κB 信号通路来减弱脂多糖刺激的促炎反应，起到抗炎作用(Lu et al. 2015)。蝉花核苷提取物包括HEA、腺苷、尿苷，可以降低损伤睾丸组织中的炎症因子水平，提高抗氧化能力(Wang et al. 2020)。

通过网络药理学的富集分析，发现蝉花核苷类成分作用的信号通路主要富集于MAPK 和 PI3K-Akt 信号通路。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)家族包括细胞外信号调节激酶(extracellular signalregulated kinase, ERK)、c-Jun 氨基末端激酶 (c-Jun N-terminal kinase, JNK)和p38 丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)，参与调节细胞增殖、分化、凋亡和炎症反应。p38 也被称为MAPK1，是MAPKs家族的亚类之一，在细胞凋亡和炎症中发挥重要作用，影响细胞死亡信号以及促凋亡(Bax)和抗凋亡(Bcl-2) (Cui et al. 2022)。Xu et al. (2024)研究发现杭白菊花蕾提取物可通过调节MAPK和Nrf2/ARE 通路缓解UVB 诱导的皮肤光老化。因此，后续体内小鼠实验主要围绕MAPK通路进行探究。

UVB 照射皮肤导致DNA 损伤，MAPK 信号通路被激活(Lee et al. 2018)，从而通过炎症反应， 促进多种炎症细胞因子的分泌， 如IL-17、TNF-α、IL-1β 是体内广泛分布的促炎因子，介导炎症、细胞凋亡和免疫反应等各种生理生化反应，并进一步促进细胞炎症因子IL-6的合成，使日光性皮炎愈加严重。与此同时，UVB 照射皮肤会产生大量的活性氧ROS，导致氧化应激，加重炎症反应。过量的ROS 积累会激活细胞内部的程序性细胞死亡或细胞凋亡，也会诱导MAPK 信号通路的激活(Xu et al.2024)。MAPK 信号通路的激活直接诱发基质金属蛋白酶分解胶原蛋白，从而导致皮肤松垮产生皱纹，这也是日光性皮炎的一大特征，所以通过马森染色测定皮肤中胶原蛋白的含量，以及测定相关指标MMP-9 的蛋白水平来追踪小鼠皮肤中胶原蛋白的含量。炎症介质的释放会促进真皮成纤维细胞凋亡，增强MMP-9 的表达，阻止胶原蛋白的表达，从而进一步诱导胶原降解，使皮肤光损伤。

诱导型前列腺素内过氧化物合成酶2(PTGS2)，又称环氧化酶-2 (COX-2)在与炎症信号相关的病理过程中发挥着重要作用，其表达和激活直接由激活细胞内炎症相关途径的促炎症细胞因子和生长因子诱导，包括内皮、上皮和免疫细胞(Tanaka et al. 2024)。内皮PTGS2 通过增强发热、疼痛和血管生成，促进炎症性疾病的发展，包括关节炎和肿瘤大部分类型的细胞都会通过激活前列腺素内过氧化物合成酶来产生前列腺素(Alexanian & Sorokin 2017)。PTGS2 定位于核膜和内质网，这与网络药理学的富集分析是一致的。

人体内储存多种抗氧化酶，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase, GST)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)，它们通过清除过量的ROS 来维持细胞氧化还原平衡。但经过UVB 照射后，抗氧化酶活性会被降低，从而破坏细胞抗氧化防御系统。活性氧的大量存在，过氧化反应的产物丙二醛间接反映了体内的活性氧含量(Kawashima et al. 2018)。

本研究的主要目的是揭示蝉花核苷提取物在细胞信号通路中的调节作用，并通过一系列实验验证其通过抑制MAPK 信号通路发挥其抗日光性皮炎的作用(图14)。蝉花核苷提取物通过多种生物学过程在日光性皮炎小鼠中发挥抗炎抗氧化作用，体现了蝉花核苷提取物多途径、多靶点的作用机制，证实了网络药理学是推动中药发展，阐明药物作用机制的一关键工具。本研究为蝉花核苷提取物在日光性皮炎治疗中的临床应用及其抗炎机制提供了科学依据。本研究还存在一些局限性，未来还将对蝉花核苷提取物皮肤毒理学以及用于治疗其他炎性皮肤病的效果和机制进行进一步的探究。

作者贡献

马悦文：实验、数据处理和论文撰写；李薇：数据整理、论文撰写，协助实验；叶向露：液相测试；龙文君：数据整理；王玉芹：指导实验设计；王春丽：指导实验构思、论文修改。

利益冲突声明

该研究不存在任何潜在利益冲突的商业或财务关系。

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